Human TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α Cytokine Kit (Flow Cytometry Multiplex Bead Assay) (流式检测试剂盒) | Bioss

本试剂盒采用CBA多因子流式检测技术，微球荧光编码不同，不同微球群上包被TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α特异性抗体，与待测样本孵育，可与样本中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α特异性结合，之后加入生物素标记的检测抗体，形成抗体包被微球-细胞因子-检测抗体的免疫复合物；最后加入藻红蛋白标记的链霉亲和素，与生物素结合，通过流式细胞仪检测，获得待测物的荧光强度，荧光强度与样本中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL- 6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α 的含量成正比，最后结合这十二种细胞因子标准品的标准曲线，从而实现对同一份样本中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α的定量检测。从而辅助判断机体的免疫功能状态。

预期用途

检测人体血清血浆和培养上清中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α的表达水平。

试剂盒组成

适用机型：本品适用于市面上的大多数有PE和APC通道的流式细胞仪。

样本要求：

血清、血浆、细胞培养上清：建议4-6小时内检测，如无法及时检测请-20℃冻存，忌反复冻融。

检验方法

1. 洗液缓冲液（1×)的准备

颠倒混合标有20×洗液的瓶子。在475 mL蒸馏水中加入20×洗液25 mL，并轻轻混合以免起泡沫。储存于2～8℃待用。

2. 标准品制备（准备8个1.5 mLEP管分别编号1.2.3.4.5.6.7.8 ）

2.1使用前按照下表将各因子的标准品用标准稀释液溶解，充分混匀，室温放置10分钟，分别从每管中取出20 μl混合，此管将被用作标准品最高浓度1号管（5000pg/ml）。

2.2 其他7个（2～8号）EP管中分别加入150 μL标准品/样品稀释液，准备梯度稀释标准品。

2.3 在1号管中转移50μL标准品到2号管充分混匀，再在2号管转移50 μL到3号管充分混匀。以同样方式依次连续稀释到7号管。

3. 捕获微球混合

确定实验孔数（包括标准品和样本），计算所需捕获微球混合液的用量。例如：待测样本88个，标准品8个,共计96孔。每个孔需要捕获微球混合液50 μL。我们可以按100孔的量进行微球混合，每个因子相应的微球大约需取500 μL。（注意：需将捕获微球涡旋20 s，充分混匀后再取）

4. 检测抗体混合

确定实验孔数（包括标准品和样本），计算所需检测的用量。例如：待测样本88个，标准品8 个，共计96孔。每个孔需要检测抗体100 μL。我们可以按100孔的量进行微球混合，每个因子相应的检测抗体大约需取1000 μL。（注意：需将捕获微球涡旋20 s，充分混匀后再取）

5. 样本处理

建议对于血清或血浆样本需使用标准品/样品稀释液进行2倍稀释。

表1

6. 操作步骤

*实验前将所有试剂取出平衡至室温；

*实验过程中，包括清洗步骤，将板子始终水平放置，以免珠子丢失；

*孵育过程中，板子应注意避光。

6.1 从梯度稀释好的标准品1-8号管中分别取出50 μL移入对应的96孔板孔中。

6.2 其余样本孔每孔加入稀释好的血清或血浆样本50 μL。

6.3 涡旋微球30 s，每孔加入50 μL微球，现每孔体积应为100 μL/孔。（加微球过程中应随时涡旋微球管，避免微球沉降，建议每加两个孔，涡旋混匀一次微球）。

6.4 将96孔板放到摇床上450 rpm/min混匀2 min。

6.5 将96孔板卡放在37℃温箱30 min。

6.6 将96孔板放在磁力板上吸附5 min，去除上清。

6.7 将96孔板从磁力板上取下，每孔加入200 μL洗液。

6.8 再将96孔板放在磁力板上5 min，去除上清。

6.9 将96孔板从磁力板上取下，每孔加入100 μL检测抗体。

6.10 37℃温箱孵育30 min。

6.11 重复步骤5.6-5.8。

6.12 将96孔板从磁力板上取下，每孔加入100 μL藻红蛋白标记的链霉亲和素。

6.13 37℃温箱孵育15 min。

6.14 重复步骤5.6-5.8。

6.15 每孔加入200 μL洗液重悬样本，上流式细胞仪检测。

7. 流式细胞仪检测

7.1 微球群分布 ：

表2

注 ：微球内部用不同强度的荧光染料染色。

7.2 模板建立：

建立X轴为FSC、Y 轴为SSC的线性散点图模板，设定混合微球位置，如说明书图1；

建议两个PE（X轴）和APC的对数散点图模板，分别显示R1门或R2门内微球，使得所有的微球群能够清楚和明显的分布于散点图上，显示各因子PE荧光强度。如说明书图2，说明书图3。调节PE PMT电压，使所有微球群左侧不压线，右侧位于PE轴检测范围内（说明书图2,3）。

7.3 样品的检测结果分析

各标准品及样本依次上机检测，对于每种微球群，应最少获取100个微球。利用标准品梯度作标曲，计算样本检测结果。

8. 软件分析

用FCAP软件进行分析

参考区间

用十项细胞因子检测试剂盒(流式荧光发光法)检测150例健康者，得到正常参考值：IL- 1β≤3.4 pg/mL、IL-2≤11.4 pg/mL、IL-4≤12.9 pg/mL、IL-6≤20. 1 pg/mL、IL-5≤8.57 pg/mL、IL-8≤15.71 pg/mL、IL-10≤5.9 pg/mL、IFN-γ≤15. 1 pg/ml、TNF-α≤6 . 1 pg/mL、IL- 12p70≤10. 18 pg/mL、IL- 17≤ 8.57 pg/mL、IFN-α≤6 . 1 pg/mL（由于环境、性别、年龄等差异，此数据仅供参考）。

检测结果的解释

1. 待检测样本细胞因子的测定在表3检测范围内，测定结果有效，可直接报告测定结果；若检测结果超出检测范围,应用标准品/样品/微球稀释液将样本稀释适当的倍数重新检测；若待测样本的检测结果低于检测下限或未检测到，则直接报告为≤最低检测值。

表3

2. 建议：负责数据揭示和出具报告的实验人员需经过正规的技术培训。

检验方法的局限性

不合理的样本采集、转运、储存、处理以及仪器的设置不当均有可能导致错误的检测结果。

产品性能指标

1. 外观和性状

试剂盒各组份应齐全、完整，液体无渗漏；外包装应完整、无破损，标签应清晰、易识别。

2. 装量

应符合要求，不低于标示值。

3. 准确度

使用本试剂盒检测已知浓度的样本，其检测结果相对偏差在±15%以内。

4. 重复性

本试剂盒检测TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17/IFN-α变异系数（CV）应≤15%。

注意事项

1. 本试剂盒仅用于科研，不用于临床诊断。

2. 实验样本、质控/标准品、实验废弃物等材料应当作为潜在传染物进行处理，并且采用符合法规的预防措施对其处理。

3. 流式细胞仪未经正确校准、荧光渗漏未进行合理补偿以及检测区域（设门）未精确定位，则可能产生错误的检测结果。请参考该仪器操作规程进行校准，确保仪器在使用前处于最佳检测状态。

4. 本品含荧光素，切勿直接接触皮肤或沾染食物，操作时务必戴手套操作。

5. 标准品在配成溶液后，请在10小时内使用。

6. 在使用之前，捕获微球混合液必须充分的振动混合。

7. 为确保荧光检测质量，凡涉及检测抗体的相关步骤都需避光操作。

8. 不同批号的试剂请勿混用，并请在有效期范围内使用。